Schillernde Biofilme von Cellulophaga lytica sind einstellbare Plattformen für skalierbare, geordnete Materialien

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13192 (2023) Diesen Artikel zitieren

774 Zugriffe

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Natur bietet viele Beispiele für Materialien, die aufgrund der hierarchischen Anordnung ihrer Bestandteile außergewöhnliche Eigenschaften aufweisen. In gut untersuchten mehrzelligen Systemen wie dem Morpho-Schmetterling ist die Darstellung der Strukturfarbe ein sichtbarer Hinweis auf geordnete Submikron-Merkmale. Detaillierte Untersuchungen der Strukturen der Natur haben zu mechanistischen Erkenntnissen geführt und zur Entwicklung biomimetischer Materialien im Labormaßstab geführt. Die Herstellung hierarchischer Baugruppen im industriellen Maßstab bleibt jedoch schwierig. Ziel der Bioproduktion ist es, die Autonomie biologischer Systeme zu nutzen, um Materialien zu geringeren Kosten und mit weniger Kohlenstoffemissionen herzustellen. Frühere Berichte dokumentierten, dass einige Bakterien, insbesondere solche mit Gleitbewegung, sich selbst zu Biofilmen mit polykristallinen Strukturen anordnen und glitzernde, schillernde Farben aufweisen. Die aktuelle Studie zeigt das Potenzial der Verwendung eines dieser Bakterien, Cellulophaga lytica, als Plattform für die groß angelegte Bioproduktion geordneter Materialien. Es werden spezifische Ansätze zur Kontrolle der optischen, räumlichen und zeitlichen Eigenschaften des C. lytica-Biofilms beschrieben. Auf Komplementärmikroskopie basierende Studien zeigen, dass Farbvariationen von Biofilmen auf Veränderungen in der Morphologie zurückzuführen sind, die durch zelluläre Reaktionen auf die lokale Umgebung hervorgerufen werden. Es wird auch die Einbindung von C. lytica-Biofilmen in Materialien demonstriert, wodurch deren Handhabung und Weiterverarbeitung, wie sie bei Herstellungsprozessen erforderlich wäre, erleichtert wird. Schließlich wird durch diese Studie der Nutzen von C. lytica als selbstdruckende, photonische Tinte nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die autonome Oberflächenanordnung von C. lytica unter Umgebungsbedingungen und über mehrere Längenskalen hinweg Herausforderungen umgeht, die derzeit die Produktion geordneter Materialien in industriellen Umgebungen behindern.

Schwankende und raue Umgebungen stellen biologische Systeme vor die Herausforderung, mildernde Überlebensstrategien zu entwickeln. Strukturelle Hierarchien sind eine vorherrschende Antwort auf solche Herausforderungen und die Grundlage für herausragende Materialeigenschaften und Funktionalität1,2. Obwohl Forscher biomimetische Materialien entwickelt haben, die die Gestaltungsprinzipien der Natur berücksichtigen, bleibt die Herstellung hierarchischer Materialien im industriellen Maßstab schwierig3,4,5. Die Bioproduktion hat das Potenzial, den Energieverbrauch und die Kohlenstoffemissionen zu senken, indem sie lebende Organismen zur Herstellung komplexer Materialien nutzt6,7,8. Ein besonderer Schwerpunkt sind Bakterientinten, bei denen eingebettete Zellen den 3D-Druck von Funktionsmaterialien ermöglichen9,10. Forscher berichten über Laborerfolge bei der Strukturierung von Bakterien zur zusätzlichen Kontrolle durch den Einsatz von Nanostrukturen, elektrischen Feldern und Optogenetik11,12,13.

Die Strukturfärbung, eine mit Bakterienkolonien verbundene Eigenschaft, entsteht durch die Wechselwirkung von Licht mit wiederkehrenden, hierarchischen Strukturen im Submikronbereich. In mehrzelligen Organismen verbessert die Strukturfarbe wesentliche Funktionen, einschließlich Lichtgewinnung, Paarung, Verteidigung und Kommunikation14,15,16,17. Beim Schillern oder der winkelabhängigen Strukturfarbe handelt es sich häufig um Kombinationen von Pigmenten, Iridophoren und mehrschichtigen Strukturen, die an Membranen in Eukaryoten befestigt sind18,19. Prokaryotische Systeme, einschließlich der Gattungen Cytophaga, Flavobacterium und Cellulophaga, zeigen ebenfalls Schillern und die genauen Mechanismen werden derzeit von mehreren Gruppen untersucht20,21,22. Das Schillern dieser Bakterien wird als Strukturfarbe mit einer winkelabhängigen Spitzenintensität definiert. Beachten Sie, dass sich dies von dem Schillern unterscheidet, das im Allgemeinen bei Schmetterlingen und Muschelschalen auftritt, bei denen die reflektierte Wellenlänge ebenfalls winkelabhängig ist. Unter Laborbedingungen organisieren sich Stämme von Cellulophaga lytica selbst zu kooperativen 3D-Gemeinschaften, sogenannten Biofilmen, und erzeugen ein Schillern diskreter Wellenlängen22,23. Die koordinierte Gleitbewegung erleichtert die Anordnung von Bakterien über große Bereiche im Nahbereich24,25,26. In Studien von Kientz et al. wurde glitzerndes Schillern durch verschiedene Stämme von C. lytica erzeugt, darunter die Meeresisolate DSM 2040 und CECT 8139 aus Meerwasseraquarien in La Jolla, USA bzw. Oleron Island, Frankreich23. Es wurde gezeigt, dass die Fähigkeit zum Gleiten und Umweltfaktoren wie Temperatur, Salzgehalt usw. einen Einfluss auf das Schillern haben20,27,28. C. lytica DSM 7489 (auch bekannt als CIP 103822 und Lim 21T; ursprünglich aus Strandschlamm in Limon, Costa Rica isoliert) war deutlich weniger schillernd und wurde in ihren Experimenten als Negativkontrolle verwendet20,22,23. Gemäß unserem Ziel, hierarchische Materialien zu entwickeln, die für die Bioproduktion geeignet sind, charakterisierte diese Studie schillernde Biofilme des kommerziell erhältlichen Stamms von C. lytica, DSM 7489, und entwickelte Strategien zur Steuerung der optischen und räumlichen Eigenschaften von Biofilmen. Damit wurde der Nutzen von C. lytica-Biofilmen als Plattform für die Entwicklung nachhaltig hergestellter geordneter Materialien demonstriert.

Cellulophaga lytica 7489-Biofilme, die 24 Stunden lang auf BB2/H2O-Medien mit verschiedenen Agarkonzentrationen gezüchtet wurden, wurden verglichen (Abb. 1A, B). Die Farbmuster unterschieden sich nach 5 Tagen, wobei das 1,0 %ige Agar die helleren Kolonien unterstützte. Kulturmedien mit mehr als 1,2 % Agar ermöglichten das Wachstum, obwohl die Ausbreitung der Kolonien im Vergleich zu Medien mit 1 % Agar oder weniger eingeschränkt war. Biofilme aus 1,5 % Agar waren kleiner und hatten eine geringere mittlere Pixelintensität. Sofern nicht ausdrücklich angegeben, basierten die übrigen Daten dieser Studie auf Biofilmen von 1 % Agarplatten, die BB2/H2O enthielten. Die fortgesetzte Inkubation auf 1 % Agar führte zu Biofilmen mit konzentrischer Gradientenfärbung (Abb. 1C). Obwohl die relativen Abmessungen und Intensitäten dieser Regionen zwischen den Proben variierten, änderte sich die Reihenfolge der Färbung in reifen Biofilmen nicht. Darüber hinaus verfärbten sich die Biofilmzentren häufig goldorange, möglicherweise aufgrund des Pigments Zeaxanthin, das bekanntermaßen in C. lytica29 vorkommt. Radial nach außen verlaufend waren die nächsten Farbbänder blau, gefolgt von einem glitzernden Grün und einem schmalen roten Band um den Umfang der Biofilme. Die Vergrößerung zeigte, dass es sich bei den Farben um Mosaike handelte, bei denen die vorherrschende Farbe in diesen Millimeterbereichen die wahrgenommene makroskopische Farbe bestimmte (Abb. 1D). Wichtig ist, dass die Mosaike das Potenzial von C. lytica-Biofilmen zeigen, eine Reihe von Farben widerzuspiegeln.

Unter bestimmten Wachstumsbedingungen bildet C. lytica 7489 intensiv schillernde Biofilme, obwohl zuvor berichtet wurde, dass es ihnen an Farbe mangelt. (A) Repräsentative C. lytica 7489-Biofilme wurden bei 27 °C auf BB2/H2O-Agarplatten mit 0,8 %, 1,0 %, 1,2 % oder 1,5 % Agar gezüchtet. Biofilme wurden 5 Tage lang jeden Tag abgebildet. Die Agarkonzentration beeinflusst die Farbsättigung und die Ausdehnung von DSM 7489 C. lytica-Biofilmen. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Flächen (i) und mittlere Intensitätsmessungen (ii) von Biofilmen in A wurden täglich mit ImageJ aufgezeichnet. Die Daten werden als Durchschnittswerte für jeden Zeitpunkt dargestellt, wobei die Standardabweichung als ±Fehler angezeigt wird (n = 10 für jeden Zeitpunkt). (C) C. lytica 7489 ist in der Lage, eine Reihe intensiver Farben zu erzeugen, wie in diesem Foto eines Biofilms gezeigt, das aus einem schrägen Betrachtungswinkel aufgenommen wurde (i) und schematisch die konzentrische Färbung zeigt (ii). (D) Optische Bilder, die zeigen, dass Bereiche des Biofilms, die makroskopisch grün (i) und rot (ii) erscheinen, Mosaike aus pointillistischen Farben sind. (Balken = 1 mm) (E) Ein repräsentativer hyperspektraler Datenwürfel zeigt regionsspezifische Variationen der Signalintensität in reifen Biofilmen. (i) Der Biofilm wurde in einer 10-cm-Petrischale auf Nähragar mit schwarzer Tinte gezüchtet. Beachten Sie, dass der Detektor senkrecht zur Oberfläche des Biofilms steht. Seine Position ist der Grund für die Verringerung der Reflexionsintensität im Vergleich zum Biofilm in (Ci). Äußere Bereiche des Biofilms erzeugen einen besonders scharfen Peak mit einer Mitte bei 550 nm, was auf eine konstruktive und kohärente Reflexion durch den Biofilm hindeutet. (ii, Ort 1) Im Gegensatz dazu bleiben die Reflexionen im mittleren Bereich nahe der Grundlinie. (ii, Standort 2)

Ein Resonon-Tisch-Hyperspektralsystem wurde verwendet, um Datenwürfel zu erzeugen, die die optischen Massenreaktionen lebender C. lytica-Biofilme darstellen (Abb. 1E). Es wurden Spektren gesammelt, die den sichtbaren Bereich abdecken und erhöhte Intensitäten in der Nähe von 550 nm zeigen. Der scharfe Peak deutet darauf hin, dass durch den Biofilm konstruktive und kohärente Reflexionen stattfinden. Im Gegensatz dazu bleiben die mit dem Zentrum des Biofilms verbundenen Intensitäten nahe dem Ausgangsniveau. In anderen Experimenten mit Rückstreugeometrie und variablen Anregungswinkeln wurde eine Abhängigkeit vom Detektionswinkel festgestellt (ergänzende Abbildung 1).

Frühere Studien zu Flavobacterium-Biofilmen zeigten, dass der Zellabstand und die Morphologie die reflektierten Wellenlängen beeinflussen21,30. Um Farbunterschiede in C. lytica 7489-Biofilmen zu verstehen, wurden ergänzende Mikroskopietechniken angewendet. Die Anordnung von C. lytica innerhalb von Biofilmen wurde mithilfe der konfokalen Mikroskopie fixierter, mit SYTO9 gefärbter Biofilme sichtbar gemacht (Abb. 2A). Bereiche des Biofilms, die nicht mit Schillern verbunden sind, enthalten zufällig ausgerichtete Zellen, es wurden jedoch auch kleine Ansammlungen ausgerichteter Zellen beobachtet. Die Zahl der in dieser Region ebenfalls vorhandenen sphärischen Strukturen nahm zu, je mehr sich die Bildebene dem Substrat näherte (ergänzende Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu waren Zellen in schillernden Regionen dicht gepackt und in planaren, polykristallinen Schichten angeordnet, wie in der schnellen Fourier-Transformation (FFT) des Bildes der grün schillernden Region bestätigt (ergänzende Abbildung 2B). Die Ordnung blieb über mehrere zehn Mikrometer bestehen, wobei die Korngrenzen durch eine Änderung der Richtung der Zellen angezeigt wurden.

Mikroskopie von Biofilmzellen. (A) Konfokale Bilder von mit SYTO9 gefärbten Biofilmen, die zeigen, dass sich die Zellorganisation zwischen nicht-irisierenden (i) und irisierenden Regionen (ii, iii) unterscheidet (Balken = 2,0 µm). (B) Transmissionselektronenmikroskopische (TEM) Querschnittsbilder von grünen (i) und roten Regionen (ii). (Balken = 0,5 µm) Einschub (iii) zeigt kleine Vorsprünge rund um die Zellwände (Balken = 200 nm). Auch die Breitenmaße (iv, v) unterscheiden sich je nach Region. (C) Höhenbilder der Rasterkraftmikroskopie (AFM) von nicht irisierenden (i), grün irisierenden (ii) und rot irisierenden (iii) Regionen, die zeigen, dass mit jeder Region unterschiedliche Zellmorphologien verbunden sind (Balken = 1,0 µm). Einschub (iv) ist ein AFM-Amplitudenbild des durch den Pfeil angezeigten Bereichs (Balken = 0,5 µm). Längenmessungen von bestimmten Biofilmregionen (v, vi). (D) 2 Tage alte Biofilme, die unter Umgebungsbedingungen auf BB2/H2O-Agar gewachsen sind (optische Maßstabsbalken = 1 mm; AFM-Balken = 3 µm). Schematische Darstellung der typischen Anordnung von Zellen in schillernden Biofilmen (i). Optisches Bild eines schillernden Biofilms. (ii) AFM-Höhenbilder (iii) und Amplitudenbilder (iv) von Zellen aus irisierendem Biofilm, die die typische stäbchenförmige Morphologie zeigen. Schematische Darstellung der vorhergesagten Anordnung von Zellen in Biofilmen, die unter Zugabe von subletalem Penicillin wachsen (v). Optisches Bild eines Biofilms, das zeigt, dass subletales Penicillin die Strukturfärbung stört. (vi) AFM-Höhenbilder (vii) und Amplitudenbilder (viii) von Zellen bestätigen die Umwandlung in Kugeln aufgrund der Penicillinbehandlung.

Eukaryoten betten Komponenten ein, die zum Schillern in Geweben beitragen und während der Untersuchung gehandhabt und manipuliert werden können. Das Schillern von C. lytica geht jedoch von unabhängigen, lose verbundenen Zellen aus, die durch mechanische Störungen, einschließlich Turbulenzen aufgrund übermäßiger Flüssigkeitszufuhr, leicht getrennt werden können. Die Vernetzung der Zellen mit Glutaraldehyd bewahrte das Schillern und ermöglichte die Entfernung intakter Biofilme vom Agar zur Charakterisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Elektronenmikroskopische Querschnittsaufnahmen von fixierten C. lytica 7489-Biofilmen bestätigten die Periodizität in schillernden Bereichen (Abb. 2B). Zellen im grünen und roten Bereich hatten eine mittlere Breite von 310 nm bzw. 428 nm, was darauf hindeutet, dass Änderungen in der Zellbreite zu Farbvariationen beitrugen. Außerdem zeigten TEM-Bilder mit höherer Vergrößerung von Zellen aus dem roten Bereich kleine Vorsprünge rund um die Zellwände (Abb. 2B-iii). Seitliche Bilder von Biofilmen, die mithilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) aufgenommen wurden, zeigen, dass die Ordnung über die gesamte Dicke der Biofilme erfolgt, die zwischen 15 und 60 µm liegt (ergänzende Abbildung 2C).

Angesichts der in den TEM-Daten beobachteten Breitenunterschiede und der Assoziation mit bestimmten Regionen des Biofilms versuchten wir, die Morphologien von Zellen mithilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) zu vergleichen (Abb. 2C). Zellen aus der nicht schillernden Region waren unregelmäßig, mit kugelförmigen Vorsprüngen verbunden und wirkten oft entleert. Im Gegensatz dazu behielten Zellen sowohl aus den rot als auch grün schillernden Regionen regelmäßige Morphologien und Abmessungen bei, wie es bei gesunden stäbchenförmigen Bakterien zu erwarten war. Trotz wiederholter Versuche, Aggregate aufzubrechen, blieben Zellen aus grün schillernden Regionen eng verbunden, was darauf hindeutet, dass die Zelloberflächeneigenschaften auch je nach Region unterschiedlich waren (Abb. 2C-ii). Im krassen Gegensatz dazu waren Zellen aus der roten Region häufig mit Membranvesikeln bedeckt (Abb. 2C-iii und iv und ergänzende Abb. 3). Es ist bekannt, dass gramnegative Bakterien, einschließlich C. lytica, äußere Membranvesikel bilden31,32. Auffällig war jedoch die vollständige Oberflächenbedeckung durch die Vesikel. Die besser definierten AFM-Bilder deuteten darauf hin, dass es sich bei den in den TEM-Querschnitten beobachteten Membranvorsprüngen um Vesikel handelte. Ein Vergleich der Längen der Zellen aus den verschiedenen Regionen ergab, dass nicht-irisierende Zellen mit Mittelwerten von 1,39 µm, 2,20 µm bzw. 2,42 µm kürzer sind als diejenigen in den grünen oder roten Regionen (Abb. 2C-v, vi). ). Zusammengenommen zeigten die Bilddaten je nach Position der Zellen im Biofilm unterschiedliche Größen- und Oberflächentopologien.

Peptidoglycan in gramnegativen Bakterien ist ein käfigartiges Polymer, das für die mechanische Stabilität der Zelle sorgt. Zwischen der Zytoplasmamembran und der Außenmembran gelegen, bestimmt seine Form die Morphologie der Bakterien. Es ist allgemein bekannt, dass Lysozym- und Beta-Lactam-Antibiotika das Peptidoglycan zerstören und zur Zelllyse führen. Bei subletalen Dosen überleben gramnegative Bakterien, einschließlich E. coli, die Behandlung, werden jedoch von Stäbchen in Kugeln umgewandelt33,34,35. Um festzustellen, ob für die Färbung intaktes Peptidoglycan erforderlich ist, wurden den Agarplatten vor der Beimpfung mit C. lytica 30 µg/ml Penicillin zugesetzt (Abb. 2D). Nach 48 Stunden fehlte den behandelten Biofilmen aufgrund der Umwandlung von C. lytica in Kugeln das Schillern, was auf die Bedeutung des Peptidoglycans für das Schillern hinweist. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass exogene formmodifizierende Reagenzien verwendet werden können, um die optischen Eigenschaften von Biofilmen zu beeinflussen.

Biofilme aus Cellulophaga lytica dehnten sich vom Inokulationspunkt aus radial aus und zeigten gebänderte Farben (Abb. 1A). Diese Musterung war wahrscheinlich eine Folge zeitlicher Unterschiede in der Zellmorphologie, die durch Veränderungen in der lokalen Umgebung (z. B. Nährstoffverfügbarkeit, pH-Wert, Metaboliten usw.) während des Zellwachstums hervorgerufen wurden. Da monochrome Biofilme konsistente Morphologien anzeigen würden, gingen wir davon aus, dass die gleichzeitige Zugabe von ausreichend Zellen zur gesamten Agaroberfläche alle Zellen gleichzeitig derselben Umgebung aussetzen und die reflektierte Farbe synchronisieren würde. Diese Hypothese wurde getestet, indem Biofilme, die mit einem lokalisierten 100-µL-Inokulum initiiert wurden, mit denen verglichen wurden, bei denen das gleiche Inokulumvolumen mithilfe eines Zellverteilers über dem Agar verteilt wurde. (Abb. 3A) Repräsentative Fotos zeigen, dass inokulierte Biofilme nach einem Tag Wachstum unter Umgebungsbedingungen ein hellgrünes Schillern um die Mitte der Platte herum reflektierten, während verteilte Biofilme auf der Plattenoberfläche diffus rot waren. Nach zwei Tagen Wachstum zeigten beide Präparate ein hellgrünes Schillern, obwohl verteilte Biofilme die gesamte Oberfläche des Agars bedeckten. Die Irisierung in dispergierten Biofilmen ließ nach 3 Tagen deutlich nach. Mit der weiteren Zeit dehnten sich die beimpften Biofilme aus und bedeckten den größten Teil der Agaroberfläche (Abb. 3B). Daher verkürzte die Verteilung der Zellen sowohl die Zeit bis zum optimalen Schillern als auch die Fläche der Platte, die mit geordneten monochromatischen Bakterien bedeckt war.

Da Kientz et al. zeigten, dass der Salzgehalt die Färbung von CECT 8139-Biofilmen beeinflusst, DSM 7489-Biofilme wurden in ähnlicher Weise getestet27 (Abb. 3C). Die Medien wurden entweder mit dem Meersalzanalogon Instant Ocean (BB2/ASW) oder Lake Products Sea Salt ASTM D1141-98 (BB2/SS) angereichert. Im Vergleich zu den verteilten Biofilmen auf BB2/H2O erzeugte das Wachstum auf BB2/ASW und BB2/SS nahezu monochrome Kolonien mit Rotverschiebungen, die mit der Menge des dem Medium zugesetzten Meersalzanalogons korrelierten. Da sich die Analoga hauptsächlich in der NaCl-Konzentration unterscheiden, haben wir getestet, ob eine Erhöhung der NaCl-Konzentration ausreicht, um die rotverschobenen Farben zu erzeugen, indem wir Biofilme auf BB2/H2O-Platten züchteten, denen unterschiedliche Mengen NaCl zugesetzt wurden (ergänzende Abbildung 4A). Steigende NaCl-Konzentrationen in lokalisierten Platten führten zu rotverschobenen Farben und ermöglichten so eine exogene Manipulation der Eigenschaften des Biofilms. Die in Abb. 1 gezeigten Bänder spiegeln die Farbpalette wider, die von C. lytica-Biofilmen erzeugt werden kann. Hier zeigen wir, dass Rot, eine frühe Farbe auf BB2/H2O-Agarplatten, durch die Erhöhung des Salzgehalts des Wachstumsmediums erzeugt wurde, während Blau durch die Verlängerung der Wachstumsperiode erzeugt wurde. Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass der zeitliche Aspekt der Färbung von zellulären Reaktionen auf die lokale Umgebung abhängt.

Monochrome Biofilme. (A) Ein Vergleich von inokulierten (i–iii) und dispergierten (iv–vi) Biofilmen bei Umgebungstemperatur. Dispergierte Biofilme erreichen ihren Höhepunkt in monochromer Farbe und füllen die Platte nach 2 Tagen (v). (B) Inokulierte Biofilme hingegen entwickeln eine Streifenfärbung und benötigen deutlich mehr Zeit, um die Oberfläche zu bedecken. (C) Fotos, die zeigen, dass die Ausbreitung von C. lytica-Zellen zu monochromen Biofilmen verschiedener Farben führt, vermutlich dadurch, dass alle Zellen gleichzeitig homogenen Wachstumsbedingungen (Nährstoffen, Metaboliten usw.) ausgesetzt werden. Auf die Farbpalette kann durch eine Verlängerung der Wachstumsperiode (i) oder eine Änderung des Salzgehalts des Mediums (ii – v) unter Verwendung von Meerwassersimulanzien zugegriffen werden. Wirksames NaCl im Rezept in Klammern. Die Platten wurden für die angegebene Zeit unter Umgebungsbedingungen gezüchtet. (D) Ein großer grüner Biofilm wurde innerhalb von 3 Tagen unter Umgebungsbedingungen erzeugt, indem ein proportionales Inokulum auf der Oberfläche einer 41 x 23 cm großen Pfanne verteilt wurde. (E) Die aufeinanderfolgende Anwendung und Verteilung von 50-fach konzentrierten Aliquots der Kultur reduziert die Bildung monochromer Biofilme auf 24 Stunden oder weniger, was darauf hindeutet, dass die Zellen sofort mit der Organisation beginnen und dass die Zelldichte ein wichtiger Gesichtspunkt für industrielle Fertigungsanwendungen sein wird. Zwischen den Zellanwendungen wurden die Platten bei 27 °C inkubiert. Weitere Versuche sind in der ergänzenden Abbildung 4E,F dargestellt.

Das Verteilen eines proportional größeren Inokulums auf einer 41 cm × 23 cm großen Agaroberfläche erzeugte nach dreitägiger Inkubation bei Raumtemperatur einen oberflächenfüllenden monochromen Biofilm, wohingegen ein lokalisiertes Inokulum zu einem eingeschränkten schillernden Bereich führte (Abb. 3D, Ergänzung 4B). Um die Zeit für die Erzeugung großflächiger monochromer Biofilme weiter zu verkürzen, haben wir getestet, ob eine Erhöhung der Zellen im Inokulum zu einer schnelleren Irisierung führt. Insbesondere wurden Übernachtkulturen konzentriert, bevor die Zellen auf dem Agar verteilt wurden. Die Geschwindigkeit, mit der das Schillern auftrat, korrelierte mit der Konzentration des über die Oberfläche verteilten Inokulums (ergänzende Abbildung 4C). Eine Schichtungsstrategie beschleunigte die Irisbildung weiter, indem 50-fach konzentrierte Zellen nacheinander auf die Agarplatten aufgetragen wurden (Abb. 3E, ergänzende Abb. 4E, 4F, 5, 6). Bemerkenswerterweise erschienen früh leuchtende gelbe und rote Reflexe, die mit der Sequenz übereinstimmten der Färbung in den beimpften Biofilmen, bei der vorübergehend Rot am Rand der beimpften Platte zu sehen ist, gefolgt von Grün. Nach 24 Stunden spiegelte sich die gesamte Platte grün. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Zellen sich schnell zu photonischen Strukturen organisieren können und dass die Zellzahl ein limitierender Faktor für die Bildung schillernder Biofilme ist.

Das Wachstum auf porösen Substraten, darunter qualitatives Filterpapier (Whatman, Grad 2), Polyester-Track-Etch-Membranen (Sterlitech), Baumwollgewebe und Seide auf Nähragar, wurde getestet. Medienretention und Nährstoffdiffusion ermöglichten das Wachstum und die Ausbreitung von Biofilmen auf diesen Substraten. Wichtig ist, dass die reflektierten Farbmuster denen von Biofilmen ähnelten, die direkt auf den Agarplatten gewachsen waren (Abb. 4). Von den getesteten Substraten wurde Filterpapier aufgrund der Qualität des schillernden Biofilms, der geringen Substratkosten und der Flexibilität für weitere Untersuchungen ausgewählt. Nach dem Wachstum wurden papierassoziierte Biofilme (PABs) zur Fixierung auf Glutaraldehyd enthaltenden Agar übertragen, um das Schillern zu bewahren. Das Papier erleichterte die Handhabung des Biofilms während der Charakterisierung und der anschließenden Verarbeitung. Das Schillern der PABs ging nach dem Trocknen verloren, wurde jedoch durch die Zugabe von Wasser schnell wiederhergestellt (Abb. 4C). PABs überstanden mehrere Trocknungs- und Rehydrierungszyklen mit minimalem Verlust der Schillerung. AFM-Aufnahmen der fixierten Papierbiofilme bestätigten die kristalline Anordnung der Zellen (ergänzende Abbildung 7B).

Das Wachstum schillernder Biofilme auf porösen Substraten, einschließlich Papier, erleichtert die Handhabung zur Charakterisierung und Weiterverarbeitung. (A) C. lytica-Biofilme wurden unter Umgebungsbedingungen auf verschiedenen porösen Substraten gezüchtet. (B) Auf Nähragar platziertes Whatman-2-Filterpapier ist eines von mehreren porösen Substraten, die es C. lytica ermöglichen, schillernde Kolonien zu bilden. Wie auf Agarplatten sind lebende papierassoziierte Biofilme (PABs) nach drei Tagen Wachstum auf BB2/H2O-Agar (Ai) grün und verfärben sich rot, wenn der Salzgehalt zunimmt, wie auf BB2/SS (A-ii). (C) PABs behalten ihr Schillern nach der Entfernung vom Agar und der Fixierung mit Glutaraldehyd (Bi). Das Trocknen der fixierten PABs mit Stickstoff führt dazu, dass sie ihr Schillern verlieren (B-ii). Allerdings wird die Strukturfarbe bei Rehydrierung wiederhergestellt (B-iii). (D) Lebende PABs behalten ihre Fähigkeit, auf Umwelteinflüsse zu reagieren. PABs von BB2/H2O-Agar reflektieren größtenteils grün, bis sie auf BB2/SS-Platten verschoben werden, wo die Reflexionen rot verschoben werden (Ci bzw. C-ii). Ebenso sind PABs, die von BB2/SS-Agarplatten stammen, rot, wechseln jedoch zu Grün, wenn sie auf BB2/H2O (C-iv bzw. Cv) platziert werden. In beiden Fällen können Biofilme wieder ihre ursprüngliche Farbe annehmen, wenn sie in den ursprünglichen Medienzustand zurückversetzt werden (C-iii und C-vi). Feste Biofilme zeigen dieses dynamische Verhalten nicht (C-vii und C-viii).

C. lytica kann als schillernder Bioink verwendet werden. (A) 3D-gedruckte Designs mit C. lytica wurden auf Agar mit einem Allevi 3 Bioprinter-Setup (Ai bis A-iv) erzeugt. Wie bereits für verteilte Biofilme gezeigt, verschiebt ein erhöhter Salzgehalt die Reflexion der C. lytica-Tinte rot. (Ergänzende Abbildung 9) (B) REM-Bild der Kante des 3D-gedruckten Biofilms, das geordnete Zellen des gedruckten Biofilms zeigt. (C, D) C. lytica zeichnet die Kanten einer Papiervorlage nach (z. B. schematisch in Ci). Der rote Kreis auf dem Schablonendesign zeigt die Impfstelle an. Zellen verhalten sich wie ein selbstdruckender Bioink, der unter Umgebungsbedingungen verschiedene Muster schreibt. (B) Eine Erhöhung der Agarkonzentration von 1,0 % (C-ii) auf 1,5 % (C-iii) verringert die Breite der Spur, wie in Keyence-Messungen (C-iv) gezeigt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Gleitmotilität so moduliert wird, dass die Zellen näher an der Matrize auf dem Agar mit höherer Konzentration gehalten werden. (D) Zusätzliche Nachzeichnungen zeigen, dass BACTracing mit Formen unterschiedlicher Komplexität, Winkel und Verbindungen verwendet werden kann. Die Agarkonzentration kann verwendet werden, um die Spuren einzugrenzen, wenn der Abstand zwischen den Merkmalen gering ist, wie dies bei komplizierten Mustern wie dem Luftwaffensymbol der Fall ist (ergänzende Abbildung 6c). (E) Vorlage eines komplexen Musters (i) und seines BACTraced-Gegenstücks (ii) nach der Fixierung, was zeigt, dass das schillernde Muster erhalten bleiben kann.

Lebende PABs (dh ohne Fixierung) behielten ihre Fähigkeit, auf Umweltreize zu reagieren. Beispielsweise reflektierten PABs auf BB2/H2O-Agarplatten größtenteils grün, bis sie auf BB2/SS-Platten verschoben wurden, wo die Reflexion rot verschoben wurde und umgekehrt (Abb. 4D). In beiden Fällen kehrten die Biofilme zu ihrer ursprünglichen Farbe zurück, als sie in den ursprünglichen Medienzustand zurückversetzt wurden (ergänzende Abbildung 8A). Diese Umkehrung trat nicht auf, wenn die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert wurden, was bestätigt, dass die Fähigkeit der lebenden Zellen, wahrzunehmen und darauf zu reagieren, für die Farbveränderungen erforderlich war. Wie bei den lokalisierten und verteilten Biofilmen können exogene Reagenzien wie Penicillin und Lysozym über das Papiersubstrat an den Biofilm abgegeben werden, um die Biofilmeigenschaften zu steuern (ergänzende Abbildung 8B).

Um geordnete Bakterientinten auf der Basis von C. lytica zu entwickeln, wurde ein Allevi 3™-Biodrucker verwendet, um die Zellen in vorprogrammierten Mustern abzulegen, und Google SketchUp, um STL-Designdateien zu erstellen, die von Formen bis zu Buchstaben reichen. Gedruckte Kulturen behielten nach Inkubation und Wachstum bei 27 °C die gewünschten Muster auf BB2/H2O-Platten bei (Abb. 5A). Die Muster wurden auch auf BB2/ASW-Agarplatten gedruckt, wo ein erhöhter Salzgehalt wiederum die Farbe rot verschob. (Ergänzende Abbildung 9A) Nachfolgende REM-Bilder der vernetzten Biofilme zeigten, dass die Bakterien in den gedruckten Formen dicht gepackt und geordnet waren (Abb. 5B).

Die Beweglichkeit von Bakteriodeten ist für die Erzeugung schillernder Biofilme erforderlich20,30. Konfokale Bilder aus dieser Studie zeigen die Ausrichtung zwischen Zellen, die wahrscheinlich auf einen gerichteten Zellfluss auf der Agaroberfläche in Kombination mit Grenzflächeninteraktionen zurückzuführen ist. Wir stellten die Hypothese auf, dass Hindernisse auf dem Weg gleitender Zellen die Richtung des Zellflusses ändern würden und dass diese behindernde Steuerung zu einer Art „selbstdruckender“ Bakterientinte führen könnte. Um diese Idee zu testen, wurden Papierschablonen auf Nähragarplatten gelegt, bevor ein Inokulum neben dem Papier hinzugefügt wurde (Abb. 5C, ergänzende Abb. 9B). Während der Inkubation erzeugten die Zellen durch einen von uns so genannten Prozess schillernde Spuren entlang der Ränder der Schablonen bakterielle autonome kollektive Verfolgung (auch bekannt als „BACTracing“). BACTracing trat sowohl auf 1 %- als auch auf 1,5 %-Agarplatten auf, die höhere Agarkonzentration führte jedoch zu schmaleren Spuren. Die Temperatur beeinflusst auch die Qualität der mit BACTracing generierten Muster (ergänzende Abbildung 10). Immer komplexere Muster wurden mit einer kleinen Anzahl von Impfstellen gedruckt, was darauf hindeutet, dass BACTracing ein einfacher Ansatz für das fortschrittliche Drucken von lebendem Material sein kann (Abb. 5E).

Die kristalline Selbstorganisation und das robuste Wachstum von C. lytica unter Umgebungsbedingungen über mehrere Längenskalen hinweg könnten genutzt werden, um Herausforderungen zu umgehen, die derzeit die Replikation geordneter Materialien in industriellen Umgebungen behindern. Wichtig ist, dass die genetische Beherrschbarkeit prokaryontischer Systeme sie für die Anpassung mithilfe der synthetischen Biologie zugänglich macht. Da das Bakterium die strukturelle Einheit darstellt, ist es möglich, dynamisches oder rekonfigurierbares Schillern zu erzeugen, indem das Verhalten und die Abmessungen eines einzelnen Zelltyps gesteuert werden. Diese Vorteile machen Bakterien, die Strukturfarben erzeugen, zu Kandidaten für großflächige, erschwingliche, „grüne“ und feldfreundliche optische Materialien sowie abstimmbare Vorlagen für geordnete Materialien. Wir haben Bedingungen identifiziert, die dazu führen, dass C. lytica DSM 7489 brillante Biofilme bildet, obwohl zuvor festgestellt wurde, dass dieser Stamm kein intensives Schillern aufweist20,22,23. Bilddaten in der aktuellen Studie zeigten, dass von diesen Biofilmen reflektierte Farbänderungen auf Variationen in der Morphologie zurückzuführen sind und dass C. lytica-OMVs möglicherweise eine Rolle bei der Farbauswahl spielen, indem sie die effektive Zellbreite vergrößern (ergänzende Abbildung 11). Schertel et al. stellten fest, dass Farbveränderungen auf Variationen der Gitterkonstanten aufgrund von Unterschieden im Interzellularabstand oder der Zelldimension zurückzuführen sind21. Johansen et al. bestätigten, dass Transposonmutanten von F. Johnsoniae aufgrund veränderter Zelldimensionen Biofilme entwickelten, die unterschiedliche Farben widerspiegelten30. Die Quantifizierung der Abstände in Biofilmen ist eine Herausforderung, da die für die Querschnittselektronenmikroskopie erforderliche Dehydrierung den natürlichen Abstand zwischen Zellen verändern kann und optische Messungen nicht über die Auflösung verfügen, um den interzellulären Abstand zu messen. Unser Ansatz zur direkten Beurteilung der Elementarzelldimensionen mithilfe der Einzelzellmikroskopie ergab, dass Biofilmbestandteile die Zellbreite als Reaktion auf ihre lokale Umgebung vorübergehend modulieren. Wichtig ist, dass genetische Veränderungen nicht wie in früheren Studien für diese phänotypischen Veränderungen verantwortlich sind. Wir kommen zu dem Schluss, dass Farbvariationen im Biofilm auf Veränderungen in der Morphologie und Zellbreite zurückzuführen sind.

Unseres Wissens stellt diese Studie den ersten Versuch dar, C. lytica-Biofilme in Materialien zu integrieren, und hebt Eigenschaften hervor, die für die Herstellung biotemplatierter Materialien im industriellen Maßstab von Vorteil sind. Ihre Selbstorganisation bei Umgebungstemperaturen vermeidet komplexe Herstellungstechniken und senkt möglicherweise die Heizkosten. Durch einfache Änderungen in der Art und Weise, wie die Zellen auf den Agar aufgetragen werden, kann eine schnelle Bildung von C. lytica-Biofilmen über die Dimensionen im Labormaßstab hinaus erreicht werden. Während die Aufrechterhaltung der Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff und Metaboliten bei großen Fermentationsprozessen eine große Herausforderung darstellt, lassen sich die Wachstumsbedingungen für Biofilme leicht aufrechterhalten und Agarbestandteile können die Eigenschaften verbessern. Wir zeigen auch, dass das Wachstum von Biofilmen auf porösen Substraten deren Handhabung beim Transfer und bei der Verarbeitung ermöglicht. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse, dass gleichmäßige Biofilme unter Umgebungsbedingungen, in nützlichem Maßstab und innerhalb praktischer Zeitrahmen erzeugt werden können. Dies sind wichtige Überlegungen für Bioproduktionsmaterialien auf Basis von C. lytica.

Die Nützlichkeit von C. lytica als bakterielle Tinte wird in dieser Studie ebenfalls demonstriert. Die Gleitmotilität von C. lytica ermöglicht das Bioprinting von Mustern auf Agaroberflächen und Umrissvorlagen über BACTracing. Da die Spureneigenschaften durch die Wachstumsbedingungen einstellbar sind, ist das Selbstdrucken komplexer Designs mit Originalität möglich. Prinzipiell lassen sich mit diesen Bioprinting-Verfahren großformatige Designs für eine Vielzahl von Anwendungen generieren. Zukünftige Studien zielen darauf ab, die auf der Zelloberfläche verfügbare chemische Vielfalt für die Entwicklung neuartiger Materialien zu nutzen. Als lebende Materialien können künstlich hergestellte Biofilme als Sensorplattformen verwendet werden, die Zustände anhand der Farbe sichtbar melden. Ein Bereich von besonderem Interesse für die Zukunft ist die Entwicklung genetischer Teile zur Manipulation schillernder Bakterien, einschließlich C. lytica. Solche Werkzeuge werden benötigt, um Ansätze der synthetischen Biologie zu ermöglichen, die die Funktionalität der Biofilme als vielseitige Plattform erweitern würden.

Alle Experimente in dieser Arbeit wurden mit Cellulophaga lytica DSM 7489 durchgeführt, die vom Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH erworben wurden. Aus den Zellen wurden Glycerinvorräte unter Verwendung von BB2/H2O, einem modifizierten Meeresmedium, hergestellt36. Pro Liter enthält BB2/H2O Difco-Meeresbrühe 2216 (18,7 g), Trypton (5,0 g), Hefeextrakt (2,5 g), Natriumchlorid (10,0 g), pH 7,8. Beachten Sie, dass sich dieses Rezept von dem in den Kientz-Studien verwendeten Rezept für Meeresagar dadurch unterscheidet, dass ein Teil der Meeresbrühe durch LB-Komponenten ersetzt wird. Wo ausdrücklich angegeben, wurden die Kulturmedien mit im Handel erhältlichen Meersalzanaloga angereichert, entweder (30–45 g/L) Instant Ocean (BB2/ASW) oder Lake Products Sea Salt ASTM D1141-98 (BB2/SS). Auf den Standard-BB2/H2O-Medien gezüchtete Biofilme wurden als Kontrollproben in Experimente einbezogen, in denen die Auswirkungen des Salzgehalts auf Wachstum und Farbe untersucht wurden. Formulierungen der Meeresbrühe und der Lake Products ASTM D1141-98 sind beim Hersteller erhältlich, sodass der NaCl-Gehalt in BB2/H2O und BB2/SS auf etwa 20 g/L bzw. 37 g/L geschätzt werden kann. Da die Zusammensetzung von Instant Ocean geschützt ist, ist die Zusammensetzung nicht beim Hersteller erhältlich. Forscher haben jedoch analytische Methoden verwendet, um die Zusammensetzung zu bestimmen, und basierend auf ihren Ergebnissen schätzen wir die NaCl-Konzentration in BB2/ASW auf etwa 29 g/L37. Flüssigkulturen wurden bei 200 U/min geschüttelt und bei 27 °C gezüchtet.

Übernachtkulturen von C. lytica 7489 wurden mit BB2/H2O verdünnt oder nach Bedarf durch Zentrifugation konzentriert, um eine OD600 von 1 zu erreichen. Gegossene 10-cm-Kulturplatten enthielten Medien, 0,8 % bis 1,5 % Agar und Zusätze (z. B. Salze, Penicillin usw.). .) wie im Text angegeben. Platten am unteren Ende des Bereichs erwiesen sich als bessere Substrate für die Expansion des schillernden Biofilms und 1,0 % Agar wurde für das routinemäßige Wachstum verwendet. Diese Bestimmung erfolgte nach einem Vergleich der Größe und Intensität von Biofilmen, die auf verschiedenen Agarkonzentrationen gewachsen waren (Abb. 1). In den meisten Fällen wurde der Agarlösung 1 % schwarze Tinte (Higgins Fountain Pen India Black) zugesetzt, um für Kontrast zu sorgen, sodass das natürliche Schillern des Biofilms leichter beobachtet werden konnte. Typischerweise wurden 10-cm-Agarplatten mit 100 μl Flüssigkultur beimpft. Um „dispergierte“ Platten herzustellen, wurden 100–400 µL Zellkultur auf die Mitte der Kulturplatte aufgetragen und anschließend mit einem Zellverteiler die Zellen auf der Agaroberfläche verteilt. Beim direkten Vergleich zwischen inokulierten und dispergierten Biofilmen wurden 100 µl Zellkultur verwendet. Die Biofilmbildung wurde beschleunigt, indem die Übernachtkultur wie angegeben konzentriert und nacheinander Aliquots der konzentrierten Zellsuspension dispergiert wurden. Diese Anwendungen wurden mit Abständen von 5 Minuten zwischen den Anwendungen wiederholt, damit das Medium vom Agar absorbiert werden konnte. Um Biofilme auf Papier wachsen zu lassen, wurden vor der Inokulation Muster von autoklaviertem qualitativem Zellulosefilterpapier Whatman Grade 2 (mit Poren von ca. 8 µm) auf Nähragar-Kulturplatten gelegt. Die Inkubationstemperaturen für die Biofilme lagen zwischen Umgebungstemperatur und 27 °C. Andere poröse Substrate wurden auf ähnliche Weise hergestellt. In definierten Abständen wurden Biofilme mit einem Leica-EZ4-HD-Mikroskop abgebildet. Mithilfe der ImageJ-Software wurden kalibrierte Bilder analysiert, um die Fläche jedes Biofilms und seine mittlere Pixelintensität zu bestimmen. Separat wurden Biofilme auch mit einer Canon PowerShot SX40 HS-Kamera fotografiert. In den meisten Fällen wurden Fotos aufgenommen, nachdem die Kulturplatte auf einer erweiterten Montageplatte mit einstellbarem Winkel platziert wurde, wie in der ergänzenden Abbildung 12 beschrieben.

Der den Biofilm umgebende Agar wurde mit einem Spatel herausgeschnitten und durch 1–2 % geschmolzenen Agar, ergänzt mit 0,5–2 % Glutaraldehyd oder 4 % Paraformaldehyd, ersetzt. Biofilme wurden über Nacht gelagert, damit das Glutaraldehyd-Fixierungsmittel durch den Biofilm diffundieren konnte. Papierbiofilme wurden zur Fixierung auf einen Klecks 1–2 % Agar mit 0,5–2 % Glutaraldehyd übertragen. Diese Präparate waren wichtig, weil sie die weitere Charakterisierung der Biofilme erleichterten und die geordnete Anordnung der Bakterien bewahrten.

Datenwürfel der optischen Massenreaktionen lebender C. lytica-Biofilme wurden mit einem Resonon-Tisch-Hyperspektralsystem generiert. Die PikaXC2-Kamera ist ein Zeilenscan-Push-Broom-Imager, bei dem jedes Bild eine einzelne Datenzeile darstellt und ein vollständiges zweidimensionales Bild durch lineares Verschieben der Probe unter der Kamera und zeilenweises Stapeln der Daten erzeugt wird. In der für diese Experimente verwendeten Konfiguration war die PikaXC2-Kamera an einer festen Position senkrecht zur Probe verankert. Vor der Datenerfassung wurde die Kamera kalibriert, um dunkles Rauschen aus den Daten zu entfernen. Außerdem wurde eine Weißkalibrierung durchgeführt, um Beleuchtung und Kamerareaktion zu berücksichtigen. Mithilfe konzentrischer Kreise wurden Bühnengeschwindigkeit und Bildrate angepasst, bis sie synchronisiert waren und ein verzerrungsfreies Bild erzeugten. Datenwürfel wurden im Reflexionsmodus bei 27 Hz gesammelt. Die Daten wurden mit Spectronon analysiert, einem Softwarepaket zur Visualisierung und Analyse hyperspektraler Daten.

Um einzelne Populationen des Biofilms zu untersuchen, wurden sterile Impfösen verwendet, um Zellen aus bestimmten Bereichen des Biofilms zu sammeln. Anschließend wurden die Zellen in Medien dispergiert, die 0,25 % Glutaraldehyd enthielten. Nach 10-minütiger Inkubation der Probe auf einem Wippschüttler wurden die fixierten Zellen durch Zentrifugation pelletiert und gewaschen. Durch eine anschließende Zentrifugation konnten die Zellen gesammelt und in einem kleineren Volumen konzentriert werden. Nachdem 5 µl der Glutaraldehyd-fixierten Suspension auf frisch gespaltenen Glimmer aufgetragen und getrocknet wurden, konnte die Probe zur AFM-Bildgebung in das Mikroskop geladen werden. Dieser Ansatz war besonders wichtig für die Beurteilung der Morphologie der Zellen, die den dünnen roten Rand bilden. Die „Pick-up“-Methode wurde auch verwendet, um Zellen aus dem Biofilm auf Glimmer oder mit Gelatine beschichteten Glimmer zu übertragen. Grundsätzlich wurde das Substrat (Glasobjektträger, einfacher Glimmer, mit Gelatine beschichteter Glimmer) auf den Biofilm umgedreht, um einen guten Kontakt zu gewährleisten, und entfernt. Schillernde und nicht schillernde Bereiche wurden mit einem Filzstift auf der Rückseite der Substrate markiert. Nach dem Anheben des Substrats wurden der Probe 20 Minuten lang 200 µl 0,25 % Glutaraldehyd zugesetzt. Lose anhaftende Zellen wurden durch kräftiges Waschen der Probe in einem Wasserstrahl entfernt. Nach dem Trocknen verbleibt eine Schicht fixierter Zellen für die Bildgebung in Luft oder Flüssigkeit. Sofern verwendet, wurden mit Gelatine beschichtete Substrate wie zuvor von Doktycz et al.38 beschrieben hergestellt.

Zur Vorbereitung der AFM-Bildgebung wurden PABs von der Agarplatte entfernt und getrocknet. Die Papierkanten wurden beim Trocknen beschwert, um ein Aufrollen zu verhindern. Die Trocknung wurde über Nacht bei Umgebungsbedingungen erreicht oder mit einem trockenen Stickstoffstrom beschleunigt. Die getrockneten Proben wurden direkt an der Luft abgebildet. Das AFM wurde entweder mit einem Bruker Icon im Tapping-Modus oder einem Keysight 9500 AFM im Akustikmodus unter Umgebungsbedingungen durchgeführt. Für die Bildgebung in Luft wurden Silizium-Cantilever (Nanosensors PPP-NCHR) mit nominellen Federkonstanten und Resonanzfrequenzen von ~ 42 N/m bzw. 330 kHz verwendet. Alternativ wurde die Flüssigkeitsbildgebung mit einem Keysight 9500 AFM im TopMac®-Modus mit MacLever-Auslegern vom Typ II mit einer nominellen Federkonstante von 2,8 N/m und einer Resonanzfrequenz von ~ 30 kHz in Wasser durchgeführt. Die Scanraten lagen zwischen 0,5 und 2,0 Hz mit 512 Datenpunkten pro Zeile.

Nach der Fixierung wurden einzelne Bereiche der Biofilme unter leichtem Rühren in ein 90 °C warmes Wasserbad überführt. Obwohl das heiße Wasser den Agar zersetzt, behält der fixierte Biofilm seine Integrität und schwimmt als Flocken frei im Wasser. Nach der Trennung sind die Biofilme im Wasser stabil und behalten das deutliche Schillern bei (ergänzende Abbildung 8). Mit Glutaraldehyd fixierte C. lytica-Filme wurden auf polymerisierte Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (2 %) gelegt, bevor sie mit geschmolzener Agarose bedeckt wurden. Die Fixierung in Osmiumtetroxid wurde über Nacht fortgesetzt. Die Fixierung in Osmiumtetroxid erfolgte nach dem Protokoll einer 2-stündigen Fixierung und anschließenden drei 15-minütigen Waschgängen in einem Hepes-Pufferwaschgang. Nach dem Waschen Dehydrierung in einer Reihe von Alkoholen für jeweils 15 Minuten (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % und dreimaliger Wechsel von 100 % Ethanol). Zur Einbettung der Proben wurde Eponharz verwendet. Zuerst werden die Proben im Verhältnis 1:3 in Harz gegeben (ein Teil Harz auf 3 Teile 100 % Ethanol für 2 Stunden). Dann 1:2 für 2 Stunden und dann 1:1 über Nacht. Am nächsten Morgen erfolgt ein frischer Wechsel in 100 % Harz für Diese Proben werden über Nacht in einen 60 °C warmen Ofen gegeben, um zu polymerisieren. Unter Verwendung eines Ultramikrotoms mit einem 35° DiaTome-Diamantmesser wurden Abschnitte von 70 nm Dicke auf Cu-Netzgittern gesammelt. Nach dem Trocknen wurden die Gitter mit RuO4 dampfgefärbt. Die TEM-Bildgebung erfolgte bei 200 kV mit einem FEI CM200. ImageJ wurde verwendet, um die Breiten der grünen und roten Blutkörperchen aus den TEM-Querschnitten zu messen und zu vergleichen.

Mit Paraformaldehyd fixierte Biofilme wurden vom Agar getrennt und 20 Minuten lang in eine Lösung von SYTO9, einem membrandurchlässigen DNA-Farbstoff, getaucht. SYTO9. Nachdem die Biofilme auf Objektträgern gesammelt worden waren, wurden sie mit einem aufrechten konfokalen Zeiss LSM 700-Mikroskop abgebildet, das mit einem 63-fach-Objektiv ausgestattet war.

Ein Allevi 3 Bioprinter wurde verwendet, um C. lytica-Zellen auf Nähragarplatten mit schwarzer Tinte zu verteilen. Mit Google SketchUp wurden STL-Dateien der Designs erstellt, die dann in die webbasierte Allevi 3 Bioprinter-Software hochgeladen wurden. Der Luftkompressor wurde eingeschaltet, damit sich der Druck auf etwa 125 PSI aufbauen konnte. Die Flüssigkultur wurde in eine 5-ml-Spritze geladen, in einen der Extruder eingesetzt und in dieser Position fixiert. Die anderen beiden Extruder wurden abgenommen und zur Seite gestellt. Als nächstes wurde eine Autokalibrierung durchgeführt, bevor eine Agarplatte auf den Bautisch gelegt und der Extruder manuell auf den richtigen X-, Y- und Z-Ursprung kalibriert wurde. Druckparameter wie Druckgeschwindigkeit und Druck wurden angepasst, um einen gleichmäßigen Kulturstrom mit minimaler Ansammlung auf der Agaroberfläche abzugeben. Als optimale Druckgeschwindigkeit wurde 2 mm/s bei einem Druck von 3,5 PSI ermittelt. Nach dem Drucken wurden Spritze und Nadel in 70 %iges Ethanol eingeweicht, um sie für zukünftige Druckaufträge zu sterilisieren. Die resultierenden Platten wurden bei 27 °C inkubiert und alle 24 Stunden auf Bakterienwachstum untersucht.

Die Papiervorlagen wurden mit einer Cricut Explore One-Schneidemaschine aus hochwertigem Zellulosefilterpapier der Güteklasse 2 von Whatman geschnitten. Die Entwürfe wurden in der bereitgestellten Software erstellt. Die Schnitte wurden mit einer Standard-Ersatzklinge auf einer leichten oder einer Standardmatte durchgeführt. Um die Leistung von C. lytica auf 1,0- und 1,5-%-BB2/H2O-Agarplatten zu vergleichen, wurden autoklavierte Matrizen auf den Agar gelegt, bevor sie an ausgewählten Stellen mit 3 µl Übernacht-Zellkultur beimpft wurden. Die Zellen wurden in definierten Abständen inkubiert und fotografiert. Die Bilder und Messungen in Abb. 5 wurden nach 4 Tagen Wachstum bei Umgebungstemperaturen aufgenommen.

Nach dem Entfernen der Papierschablonen wurden biotracete Quadrate aus dem Agar herausgeschnitten und auf einen Siliziumwafer übertragen (ohne Fixierung). Nachdem die Probe auf dem konfokalen 3D-Laser-Scanning-Mikroskop von Keyence (Profile Measurement VK-X200-Serie) platziert wurde, wurden mit einem 5-fach-Objektiv Bilder von drei nicht überlappenden Bereichen auf jeder Seite des Quadrats gesammelt, mit Ausnahme der Seite mit der Impfstelle . Jedes Sichtfeld wurde in etwa drei gleiche Bereiche unterteilt. In jedem Bereich des kombinierten optischen/Laser-Bildes wurde eine Querschnittsmessung durchgeführt, was insgesamt 27 Messungen pro Quadrat ergab. Für die Bildverarbeitung wurde das mit dem Keyence-System mitgelieferte Multifile-Analysemodul verwendet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

Sun, JY, Bhushan, B. & Tong, J. Strukturelle Färbung in der Natur. RSC Adv. 3, 14862–14889. https://doi.org/10.1039/c3ra41096j (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Tadepalli, S., Slocik, JM, Gupta, MK, Naik, RR & Singamaneni, S. Biooptik und bioinspirierte optische Materialien. Chem. Rev. 117, 12705–12763. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.7b00153 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, W. et al. Schmetterlingseffekte: Neuartige Funktionsmaterialien, inspiriert von den Flügelschuppen. Physik. Chem. Chem. Physik. 16, 19767–19780. https://doi.org/10.1039/c4cp01513d (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhou, H. et al. Bioinspirierte photonische Materialien: Prototypen und Struktureffektdesigns für Anwendungen in der Solarenergiemanipulation. Adv. Funktion. Mater. https://doi.org/10.1002/adfm.201705309 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chung, K. et al. Flexible, winkelunabhängige, strukturelle Farbreflektoren, inspiriert von Morpho-Schmetterlingsflügeln. Adv. Mater. 24, 2375–2379. https://doi.org/10.1002/adma.201200521 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Groll, J. et al. Biofabrikation: Neubewertung der Definition eines sich entwickelnden Feldes. Biofabrikation https://doi.org/10.1088/1758-5090/8/1/013001 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Mironov, V. et al. Biofabrikation: Ein Fertigungsparadigma des 21. Jahrhunderts. Biofabrikation https://doi.org/10.1088/1758-5082/1/2/022001 (2009).

Artikel PubMed Google Scholar

Ullah, MW et al. Mikroben als Strukturvorlagen in der Biofabrikation: Untersuchung der Oberflächenchemie und Anwendungen. ACS Sustain. Chem. Ing. 5, 11163–11175. https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.7b02765 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Lehner, BAE, Schmieden, DT & Meyer, AS Ein unkomplizierter Ansatz für den 3D-Bakteriendruck. ACS Synth. Biol. 6, 1124–1130. https://doi.org/10.1021/acssynbio.6b00395 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balasubramanian, S., Aubin-Tam, ME & Meyer, AS 3D-Druck zur Herstellung von funktionellen lebenden Materialien auf Biofilmbasis. ACS Synth. Biol. 8, 1564–1567. https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00192 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hochbaum, AI & Aizenberg, J. Bakterien bilden spontan Muster auf periodischen Nanostruktur-Arrays. Nano Lett. 10, 3717–3721. https://doi.org/10.1021/nl102290k (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Moser, F., Tham, E., Gonzalez, LM, Lu, TK & Voigt, CA Lichtgesteuerte, hochauflösende Musterung lebender gentechnisch veränderter Bakterien auf Textilien, Keramik und Kunststoff. Adv. Funktion. Mater. https://doi.org/10.1002/adfm.201901788 (2019).

Artikel Google Scholar

Samantaray, K., Mishra, SR, Purohit, G. & Mohanty, PS Durch Wechselstromfelder vermittelte Anordnung bakterieller Tetraden. ACS Omega 5, 5881–5887. https://doi.org/10.1021/acsomega.9b04124 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez-Garcia, M. et al. Lichtinduzierte dynamische Strukturfarbe durch intrazelluläre 3D-Photonenkristalle in Braunalgen. Wissenschaft. Adv. https://doi.org/10.1126/sciadv.aan8917 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vignolini, S. et al. Pointillistische Strukturfarbe in Pollia. Proz. Natl. Acad. Wissen USA 109, 15712–15715. https://doi.org/10.1073/pnas.1210105109 (2012).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Doucet, SM & Meadows, MG Irideszenz: Eine funktionale Perspektive. JR Soc. Schnittstelle 6, S115–S132. https://doi.org/10.1098/rsif.2008.0395.focus (2009).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Krishna, A. et al. Infrarotoptische und thermische Eigenschaften von Mikrostrukturen in Schmetterlingsflügeln. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 117, 1566–1572. https://doi.org/10.1073/pnas.1906356117 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berthier, S., Charron, E. & Boulenguez, J. Morphologische Struktur und optische Eigenschaften der Flügel von Morphidae. Insektenwissenschaft. 13, 145–158. https://doi.org/10.1111/j.1744-7917.2006.00077.x (2006).

Artikel Google Scholar

Giraldo, MA, Parra, JL & Stavenga, DG Schillernde Färbung des männlichen Anna-Kolibris (Calypte anna), verursacht durch mehrschichtige Barteln. J. Comp. Physiol. Ein Neuroethol. Sens. Neuronales Verhalten. Physiol. 204, 965–975. https://doi.org/10.1007/s00359-018-1295-8 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kientz, B. et al. Glitzerartiges Schillern innerhalb der Bakterioiden, insbesondere Cellulophaga spp.: Optische Eigenschaften und Korrelation mit der Gleitmotilität. PLoS ONE https://doi.org/10.1371/journal.pone.0052900 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schertel, L. et al. Komplexe photonische Reaktion offenbart dreidimensionale Selbstorganisation strukturell gefärbter Bakterienkolonien. JR Soc. Schnittstelle 17, 20200196. https://doi.org/10.1098/rsif.2020.0196 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kientz, B. et al. Eine einzigartige Selbstorganisation bakterieller Untergemeinschaften erzeugt Schillern in Biofilmen von Cellulophaga lytica-Kolonien. Wissenschaft. Rep. https://doi.org/10.1038/srep19906 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kientz, B., Vukusic, P., Luke, S. & Rosenfeld, E. Irideszenz eines Meeresbakteriums und Klassifizierung prokaryotischer Strukturfarben. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 2092–2099. https://doi.org/10.1128/aem.07339-11 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wartel, M. et al. Eine vielseitige Klasse von Richtungsmotoren auf der Zelloberfläche führt bei Myxococcus xanthus zu Gleitmotilität und Sporulation. PLoS. Biol. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001728 (2013).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nan, B. Bakterielle Gleitmotilität: Einführung eines Konsensmodells. Curr. Biol. 27, R154–R156. https://doi.org/10.1016/j.cub.2016.12.035 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McBride, MJ Cytophaga-flavobacterium Gleitmotilität. J. Mol. Mikrobiol. Biotechnologie. 7, 63–71. https://doi.org/10.1159/000077870 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kientz, B., Marie, P. & Rosenfeld, E. Einfluss abiotischer Faktoren auf das einzigartige glitzernde Schillern von Cellulophaga lytica. FEMS Mikrobiol. Lette. 333, 101–108. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2012.02614.x (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sato, K. et al. Kolonieausbreitung des Gleitbakteriums Flavobacterium johnsoniae in Abwesenheit des Motilitätsadhäsins SprB. Wissenschaft. Rep. 11, 16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-79762-5 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Silva, TR et al. Pigmente in einem schillernden Bakterium, Cellulophaga fucicola, isoliert aus der Antarktis. Antonie Van Leeuwenhoek 112, 479–490. https://doi.org/10.1007/s10482-018-1179-5 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Johansen, VE et al. Genetische Manipulation der Strukturfarbe in Bakterienkolonien. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 115, 2652–2657. https://doi.org/10.1073/pnas.1716214115 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Freckelton, ML, Nedved, BT & Hadfield, MG Induktion der Larvenansiedlung von Wirbellosen; Unterschiedliche Bakterien, unterschiedliche Mechanismen? Wissenschaft. Rep. https://doi.org/10.1038/srep42557 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwechheimer, C., Sullivan, CJ & Kuehn, MJ Hüllenkontrolle der Vesikelproduktion der Außenmembran in gramnegativen Bakterien. Biochemie 52, 3031–3040. https://doi.org/10.1021/bi400164t (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Spratt, BG Bestimmte Penicillin-bindende Proteine, die an der Teilung, Verlängerung und Form von Escherichia coli-K12 beteiligt sind. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 72, 2999–3003. https://doi.org/10.1073/pnas.72.8.2999 (1975).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spratt, BG & Pardee, AB Penicillin-bindende Proteine und Zellform in Escherichia coli. Natur 254, 516–517. https://doi.org/10.1038/254516a0 (1975).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Popham, DL & Young, KD Rolle von Penicillin-bindenden Proteinen bei der Morphogenese bakterieller Zellen. Curr. Meinung. Mikrobiol. 6, 594–599. https://doi.org/10.1016/j.mib.2003.10.002 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bird, LJ et al. Entwicklung eines genetischen Systems für Marinobacter atlanticus CP1 (sp. nov.), einen Wachsester produzierenden Stamm, der aus einer autotrophen Biokathode isoliert wurde. Vorderseite. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.03176 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Holder, EL, Conmy, RN & Venosa, AD Vergleichende Labortests der Dispergiermittelwirksamkeit von 23 Rohölen unter Verwendung von vier verschiedenen Testprotokollen. J. Umgebung. Prot. 6, 628 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Doktycz, MJ et al. AFM-Bildgebung von Bakterien in flüssigen Medien, die auf mit Gelatine beschichteten Glimmeroberflächen immobilisiert sind. Ultramikroskopie 97, 209–216. https://doi.org/10.1016/s0304-3991(03)00045-7 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren bedanken sich für die finanzielle Unterstützung dieses Projekts durch das AFRL Materials and Manufacturing Directorate und sein Forschungsteam für Biomaterialien und Verarbeitung. Wir danken auch für die finanzielle Unterstützung durch das Summer Faculty Fellowship-Programm der AFRL.

Direktion für Materialien und Fertigung, Air Force Research Laboratory, Wright Patterson Air Force Base, OH, 45433, USA

Claretta J. Sullivan, Kennedy Brown, Chia-Suei Hung, Joseph Kuo-Hsiang Tang, Mark DeSimone, Vincent Chen, Pamela F. Lloyd, Maneesh Gupta, Abby Juhl, Wendy Crookes-Goodson, Milana Vasudev, Patrick B. Dennis und Nancy Kelley-Loughnane

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Massachusetts Dartmouth, Dartmouth, MA, 02747, USA

Mark DeSimone & Milana Vasudev

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

CJS, MG, WCG, NKL, MV, PD – Studienkonzeption und Design. CJS, KB, CH, JKT, MD, VC, PL, MV – Datenerfassung. CJS, KB, CH, JKT, MD, VC, PL, MV, MG, PD, AJ, WCG, NKL – Analyse und Interpretation der Ergebnisse. Vorbereitung des Manuskriptentwurfs für CJS, KB, PD. CJS, KB, CH, JKT, MD, VC, PL, MG, AJ, WCG, MV, PD, NKL – überprüftes Manuskript.

Korrespondenz mit Claretta J. Sullivan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Zusatzvideo 1.

Zusatzvideo 2.

Zusatzvideo 3.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Sullivan, CJ, Brown, K., Hung, CS. et al. Schillernde Biofilme von Cellulophaga lytica sind einstellbare Plattformen für skalierbare, geordnete Materialien. Sci Rep 13, 13192 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38797-0

Zitat herunterladen

Eingegangen: 02. Dezember 2022

Angenommen: 14. Juli 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38797-0

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.

Blog

Schillernde Biofilme von Cellulophaga lytica sind einstellbare Plattformen für skalierbare, geordnete Materialien